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二代測(cè)序快速DNA建庫(kù)試劑盒（Illumina）說(shuō)明書(shū)

NGS Fast DNA Library Prep Set

for Illumina

二代測(cè)序快速DNA建庫(kù)試劑盒（Illumina）說(shuō)明書(shū)

目錄號(hào)：K2585

運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)輸。

保存條件：-20℃保存。

組分說(shuō)明

       Size                                10        24         96

       End Prep Enzyme Mix                20μl      48 μl      192 μl

       10x End Repair Reaction Buffer     80μl      200 μl     800 μl

       T4 DNA ligase                      20μl      48 μl      192 μl

       T4 DNA ligase Buffer               160μl     400 μl   2×800 μl

       HiFidelity 2×PCRMasterMix          250μl     600 μl   2×1.2 ml

              本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

　　本試劑盒提供了DNA文庫(kù)構(gòu)建所需要的酶預(yù)混體系及反應(yīng)緩沖液，包含除接頭與PCR引物外的所有成分，用于illumina二代測(cè)序平臺(tái)DNA文庫(kù)構(gòu)建。和一般建庫(kù)方法相比，該試劑盒操作簡(jiǎn)單、方便，極大地縮短了文庫(kù)構(gòu)建時(shí)間。另外，試劑盒采用高保真DNA聚合酶進(jìn)行文庫(kù)富集，無(wú)偏好的 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)大了序列的覆蓋區(qū)域，可高效制備用于illumina二代測(cè)序平臺(tái)的DNA文庫(kù)。試劑盒中提供的所有試劑都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證，最da程度上保證了文庫(kù)構(gòu)建的穩(wěn)定性。

產(chǎn)品特點(diǎn)

·末端補(bǔ)平，磷酸化，加A一步完成。

·不需純化，直接加接頭。

·超保真擴(kuò)增，最da程度上降低了擴(kuò)增偏好性。

·支持多種樣本，且所得文庫(kù)能夠用于Illumina GAIIx，HiSacnSQ、HiSeq  2500/2000

  /1000和MiSeq sequencing等測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序。

自備儀器、試劑和耗材

1．磁力架：建議使用DynaMag            TM-2

                                 (Cat.No. 12321D)。

2．DNA純化回收試劑盒：建議使用研謹(jǐn)磁珠法DNA純化回收試劑盒 (Cat.No. K2508)。

3．樣本接頭引物試劑盒：建議使用研謹(jǐn)二代測(cè)序多樣本接頭引物試劑盒   I/II (Cat. No.

   K2586/K2587）。

4．無(wú)水乙醇，EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.0)，去離子水（pH 在7.0-8.0之間）。

5．反應(yīng)管：建議使用低吸附的PCR管與1.5 ml離心管；

   槍頭：建議使用高質(zhì)量過(guò)濾槍頭防止試劑盒、文庫(kù)樣本污染。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)

1．避免試劑的反復(fù)凍融。

2．PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極易產(chǎn)生污染，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，建議將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)與PCR產(chǎn)物純化區(qū)隔離，并使用專(zhuān)門(mén)的移液器，定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔。

DNA建庫(kù)流程示意圖

  2小時(shí)40分鐘得到DNA文庫(kù)

1.  DNA末端修復(fù)（~50min）

2.  Adaptor連接（~15min）

3.連接adaptor后的DNA片段的選擇性回收

    4.PCR擴(kuò)增 （~15min）

    5.PCR產(chǎn)物純化 （30min）                              

補(bǔ)平、磷酸化、加A一步完成

         兩步操作一管完成

操作步驟

樣本要求：  5ng-1μg打斷的雙鏈DNA，溶于EB（10 mM Tris-HCl pH 8.0)或去離子水中。

DNA純度要求：OD260/OD280=1.8~2.0。

DNA末端修復(fù)反應(yīng)

1．向200μl PCR管中加入以下試劑：

                 試劑名稱(chēng)                             體積

                 10x End Repair Reaction Buffer     6.5μl

                 End Prep Enzyme Mix              2μl

                 fragmented DNA                   X（5ng-1μg）

                 RNase-free Water                 Up to 65μl

2．用槍頭將上述溶液輕輕吹吸混勻，短暫離心,使所有組分收集到管底。

3．將上述PCR管置于PCR儀中，熱蓋打開(kāi)，反應(yīng)程序如下：

        15 min @ 12℃

        15 min @ 37℃

        20 min @ 72℃

        Hold on 4℃

Adaptor連接

建議使用研謹(jǐn)adaptor進(jìn)行連接，也可選擇使用NEB、illumina公司的adaptor，具體連接方法可參考各公司的產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)。以下為使用研謹(jǐn)adaptor進(jìn)行連接的操作步驟：

1．向上述已完成DNA末端修復(fù)的反應(yīng)液中直接加入以下試劑：

試劑名稱(chēng)                            體積

T4 DNA ligase buffer for illumina        14  μl

T4 DNA ligase                        2  μl

Adaptor                             2.5  μl

   此時(shí)管中溶液總體積為83.5 μl。

   注意：若起始樣本量少于100 ng，請(qǐng)將adaptor用去離子水稀釋10倍至1.5 μM后使用。

2．用槍頭將上述試劑吹吸混勻，短暫離心，使溶液收集到管底。

3．20℃溫浴15分鐘。

   注意：若此操作使用pcr儀，請(qǐng)將熱蓋關(guān)閉。

DNA_-#片段的選擇性回收

建議使用上海研謹(jǐn)磁珠法DNA純化回收試劑盒（K2508）進(jìn)行DNA+#片段選擇性回收。

注意：DNA+#片段選擇性回收是可選步驟，若起始樣本量低于50ng，不建議進(jìn)行DNA+#片段選擇性回收，可參考說(shuō)明書(shū)第4頁(yè)，直接進(jìn)行DNA+#片段的純化。另外構(gòu)建不同大小的DNA文庫(kù)時(shí)，DNA+#片段選擇性回收的磁珠使用量不同，具體磁珠用量可參照附表1（若使用除研謹(jǐn)以外廠(chǎng)家的磁珠，需自行摸索最佳磁珠用量）。

以下操作步驟中，可選擇回收DNA+#片段長(zhǎng)度峰值為320bp（插入片段長(zhǎng)度200bp），反應(yīng)起始體積為100 μl。

1．渦旋振蕩CMPure20秒，使其*混勻?yàn)榫蝗芤骸?/span>

2．向連接反應(yīng)液中加入16.5 µl去離子水，使adaptor連接反應(yīng)緩沖液體積至100μl。

   注意：若使用NEB adaptor，只需要加入13.5μl去離子水。

3．將上述adaptor反應(yīng)緩沖液轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心管中。

4．加入60 µl混合均勻的CMPure，渦旋震蕩5秒鐘后, 室溫靜置5分鐘。

5．短暫離心，將離心管置于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清（約需5 分鐘），小心地將上清溶液轉(zhuǎn)移

至新的1.5 ml離心管中,并棄去磁珠。

   注意：不要棄除上清。

6．向上清中加入20 µl混合均勻的CMPure，渦旋震蕩5秒鐘后室溫放置5分鐘。

7．短暫離心，將離心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清（約需5分鐘），小心吸取上清并棄除，期

間避免接觸已結(jié)合目標(biāo)DNA的磁珠。

   注意：不要棄除磁珠。

8．繼續(xù)保持離心管固定于磁力架上，向離心管中加入250 µl新配置的80%乙醇，室溫放置30秒，待懸起的磁珠*吸附

后，小心棄除上清。

9．重復(fù)步驟8。

10.保持離心管固定于磁力架上，室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥。

11.將離心管從磁力架上取下，加入 28 µl 10 mM  Tris-HCl（pH 8.0）或去離子水（自備），渦旋振蕩使磁珠*重懸于洗

脫液中，室溫靜置5分鐘。

12.短暫離心，將離心管放于磁力架上直至溶液澄清（約需 5分鐘），將23 μl洗脫液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的PCR管中；

   注意：一定不要轉(zhuǎn)移磁珠，微量磁珠污染可影響后續(xù)PCR反應(yīng)的正常進(jìn)行。

另一種方案：DNA+#片段的純化

1．渦旋振蕩CMPure20秒，使其*混勻?yàn)榫蝗芤骸?/span>

2．將adaptor連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至一新的1.5 ml離心管中。

3．加入1倍樣品體積的CMPure，渦旋震蕩5秒鐘后，室溫靜置5分鐘。

4．短暫離心，將離心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清（約需5分鐘），小心吸取上清并棄除，期

間避免接觸已結(jié)合目標(biāo)DNA的磁珠。

   注意：不要棄除磁珠。

5．繼續(xù)保持離心管固定于磁力架上，向離心管中加入 250 µl新鮮配置的80%乙醇，室溫放置30秒，待懸起的磁珠*吸附

后，小心棄除上清。

6．重復(fù)步驟5。

7．保持離心管固定于磁力架上，室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥。

8．將離心管從磁力架上取下，加入28 µl EB（自備）或去離子水，渦旋振蕩使磁珠完全重懸于洗脫液中，室溫靜置5鐘。

9．短暫離心，將離心管放于磁力架上直至溶液澄清（約需 5分鐘），將23 μl洗脫液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的PCR管中。

PCR擴(kuò)增

1．在PCR管中加入以下試劑并混勻。

                       試劑名稱(chēng)                          體積

                       連接adaptor后的DNA片段              23 μl

                       HiFidelity 2X PCR Master Mix          25 μl

                       Univesial primer                      1 μl

                       Index primer                         1 μl

                       總體積                           50 μl

2．PCR反應(yīng)條件。

                    步驟              溫度             時(shí)間

                    預(yù)變性             98℃            30 s

                    變性              98℃            10 s

                    退火              65℃            30 s    6-16個(gè)循環(huán)

                    延伸              72℃            30 s

                    終延伸             72℃            5 min

注意：建議1 μg樣本起始量時(shí)PCR循環(huán)數(shù)為6個(gè)循環(huán)，50 ng時(shí)10個(gè)循環(huán)，5 ng時(shí)14-15個(gè)循環(huán)，PCR循環(huán)數(shù)也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需

要進(jìn)行優(yōu)化。

PCR產(chǎn)物的純化

1．渦旋振蕩CMPure20秒，使其*混勻?yàn)榫蝗芤骸?/span>

2．將PCR反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至一新的1.5 ml離心管中。

3．加入1倍樣品體積的CMPure，渦旋震蕩5秒鐘后室溫靜置5分鐘。

4．短暫離心，將離心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分離，直至溶液澄清（約需5分鐘）。小心吸取上清并棄除，期

間避免接觸已結(jié)合目標(biāo)DNA的磁珠。

   注意：不要棄除磁珠。

5．繼續(xù)保持離心管固定于磁力架上，向離心管中加入 250 µl新鮮配置的80%乙醇，室溫放置30秒，待懸起的磁珠*吸附

后，小心棄除上清。

6．重復(fù)步驟5。

7．保持離心管固定于磁力架上，室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥。

8．將離心管從磁力架上取下，加入30 µl EB（自備）或去離子水，渦旋振蕩使磁珠*

   重懸于洗脫液中，室溫靜置5分鐘。

9．短暫離心，將離心管放于磁力架上直至溶液澄清（約需5分鐘），將洗脫液轉(zhuǎn)移至一

   個(gè)新的PCR管中約25 μl，DNA文庫(kù)在-20℃保存。

文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)

文庫(kù)濃度

為了得到高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果，需要對(duì) DNA文庫(kù)進(jìn)行精確定量，首先推薦使用Real-timePCR方法對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行絕對(duì)定量。

此外，還可使用熒光染料法，如Qubit法或熒光染料picogreen法，此處請(qǐng)勿使用基于吸光度測(cè)量的定量方法。最終可使用以

下近似公式換算DNA文庫(kù)的摩爾濃度。

          文庫(kù)平均總長(zhǎng)度       近似轉(zhuǎn)換公式       成簇反應(yīng) DNA文庫(kù)濃度

                  200 bp       1 ng/μl=7.5 nM        6-12 pM

                  300 bp       1 ng/μl=5.0 nM        6-12 pM

                  400 bp       1 ng/μl=3.8 nM        6-12 pM

                  500 bp       1 ng/μl=3.0 nM        6-12 pM

文庫(kù)長(zhǎng)度分布

制備好的DNA文庫(kù)可用瓊脂糖凝膠電泳或Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)DNA文庫(kù)中的片段長(zhǎng)度分布范圍。

 L   S

 圖1：Agilent 2100 Bioanalyzer文庫(kù)分析結(jié)果

 L：DNA Ladder；

S：使用200ng人基因組DNA構(gòu)建文庫(kù)，磁珠進(jìn)行選擇回收后結(jié)果。

    文庫(kù)結(jié)構(gòu)

    5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC

    GATCT [Target Sequence] TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNN

    NNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

    NNNNNN：index, 6bases

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：